1980'lerin ortasında, Cihazlar ve Radyolojik Sağlık (CDRH) için ABD Gıda ve İlaç İdaresi Merkezi son hayatta kalan spor üzerinde odaklanan yedi günden daha az azaltılmış inkübasyon zamanı (RIT) tesisi için bir protokol yayınlamıştır. Bu protokol Birleşik Devletler dışında geniş çapta kabul görmüştür. Bu çalışmada elde edilen veriler dünya genelinde kabul edilmiş olan RIT protokolünün ISO geliştirilmesini kolaylaştırmak için verilmektedir. Bu çalışma, spor çimlenmesini ve üreme kabiliyetlerini daha derinden anlaşılmasına imkan veren, 105Geobacillus Stearothermophilus sporları içeren Biyolojik İndikatörler ve devamlı olarak inkübe olan Biyolojik İndikatörleri gözlemleyen ve steril olmayan (büyüme-pozitif) sonuçları dakika-dakika esasına göre kaydeden yeni bir teknoloji kullanmıştır. Yaklaşık 4000 veri noktasının analizi bir Biyolojik İndikatör üzerinde canlı kalan sporların adedi ve tespit edilecek steril olmayan bir sonuç için gerekli olan tüm inkübasyon süresi arasında ters bir ilişki olduğunu göstermiştir. Birkaç yüz canlı kalan sporlu Biyolojik İndikatörler içindeki steril olmayan sonuçlar normal olarak dağıtılmış görünmektedir. Her Biyolojik İndikatör için canlı kalan sporlar azaldıkça, çeşitlilik ve büyüme zamanı artmaktadır ve sadece bir canlı [viyabl] spor içeren Biyolojik İndikatörler en uzun büyüme süreleri sergilemektedir.
Biyolojik İndikatörler (BIs) tıbbi ürünler için sterilizasyon etkinliğini gözlemlemek için global olarak kullanılmaktadır. BI'ler, tasarlanmış oldukları sterilizasyon işlemine yüksek derecede dayanıklı yüksek sayıda bakteri endosporları– genellikle 104 ila 106 – içerirler. Sporlar kağıt gibi bir taşıyıcı materyal üzerine veya içine yerleştirilirler ve sterilizasyondan önce veya sonra ve kültür işleminden önce Biyolojik İndikatörü korumak için paketlenirler. Biyolojik İndikatörler etilen oksit, buhar, kuru ısı, düşük ısı buhar formaldehit, buhar hidrojen peroksit, ve ilgili plazma sterilizasyon sistemlerinin geçerliliği ve rutin gözlemlenmesi [monitorajı] için faydalıdır.
Birleşik Devletlerde, sağlık bakım tesislerinde kullanım için satılan Biyolojik İndikatörler tıbbi cihaz olarak kabul edilirler ve 1996 tarihli Kalite Sistem Yönetmeliğinde bildirildiği şekilde ABD Gıda ve İlaç İdaresi ticari mal imalat uygulamaları (GMPs) tarafından düzenlenirler. Steril tıbbi ürünler imalatçılarına satılan Biyolojik İndikatörler imalat bileşenleri olarak dikkate alınırlar. Amaçlanan kullanımına bakılmaksızın, Kalite, yeniden üretilebilirlik ve tahmin edilebilirlik performansını sağlamak için Biyolojik İndikatörler dikkatle kontrol edilen şartlarda imal edilmelidirler.
Biyolojik İndikatör inkübasyon zamanını azaltma ve mevcut FDA protokolü
Sterilizasyon işleminin kabul edilebilirliği ile ilgili kullanıcının doğru bir karar vermesine imkan vermeye yeterli bilgi sağlamak için ne kadar inkübasyon zamanı gereklidir? 1980'lerin ortasında FDA Cihaz ve Radyolojik Sağlık (CDRH) Merkezi Biyolojik İndikatör imalatçıları ve kullanıcılar için, Biyolojik İndikatörlerin inkübasyon süresini normal yedi günden daha kısa bir süreye azaltmada takip etmek için bir protokol yayımlamıştır (bundan sonra bu belgede RIT [azaltılmış inkübasyon süresi] protokolü olarak adlandırılacaktır), burada protokol içinde tanımlanan test sonuçları esas alınmaktadır. RIT protokolü imalatçıların üç lotun her birinden 100 Biyolojik İndikatörün ayrı sterilizasyon işlemlerine maruz bırakılmalarını gerektirmektedir;
Sterilizasyon işlemlerine maruz bırakma sonuçları, uygun şartlarda yedi gün inkübasyondan sonra her lottan 30 ila 80 steril olmayan Biyolojik İndikatörle sonuçlanmalıdır. Bu sonucu elde etme, oldukça yüksek özelleştirilmiş sterilizasyon ekipmanının genellikle kullanıldığı dikkatle-kontrol edilen azaltılmış letalite (fraksiyonel) sterilizasyon çalışması gerektirir.
RIT protokolüne gere bir Biyolojik İndikatör/sterilizasyon işlemi için azaltılmış inkübasyon süresini belirlemek için, üç lotun her biri için steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin adedi periyodik incelemelerden sonra yedi güne kadar olan inkübasyon süresinden sonra kaydedilir; yedi gündeki steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin adedi "% 100" kabul edilir. Yedi günden az inkübasyon sürelerindeki steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin adedi ilgili yedi-günlük değer ile karşılaştırılır, ve bir yüzde hesaplanır, üç lotun biri veya birden fazlası için gerekli niteliklere sahip azaltılmış inkübasyon süresi en uzun süredir, steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin adedi yedi günlük inkübasyondan sonra gözlemlenenin % 97.0'na eşit veya bundan küçüktür. Tipik bir örnek Biyolojik İndikatörlerin günlük olarak değerlendirildiği Çizelge I içinde görünmektedir
Şekil 1: Pozitif bir test tespiti ile ilgili gecikmiş filizlenme ve artan üreme süresinin etkileri
Gerekli olduğundan, test edilen üç lotun her biri için, yedi günlük inkübasyondan sonra steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin adedi 30 dan daha büyüktü veya buna eşitti ve 80'den daha azdı veya buna eşitti. Lot 2 ve lot 3 için, % 97.0'lık kriter bir günlük inkübasyondan sonra karşılanmıştır; bununla birlikte lot 1 için % 97.0 kriteri iki günlük inkübasyondan sonra karşılanmıştır. Bu sonuçlar esasına göre, yedin günden iki güne inkübasyon süresinin azaltılması kabul edilebilir.
RIT protokolünün uygulanması
Biyolojik İndikatörlerin kullanıcılarının ve imalatçılarının her ikisinin de, Biyolojik İndikatörler için inkübasyon süresinin kısaltılmasını yeterli olarak vasıflandırmak için olan bu yaklaşımın birkaç yönü hakkında dile getirilmiş kuşkuları vardır:
·Steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin adedi için 30 ila 80 "penceresi" çok dardır; bu gibi sonuçları veren sterilizasyon ortamını tanımlamak zordur. Genellikle, bu pencere içinde kalan sonuçlar sağlamak için verilen lot üzerinde birçok sterilizasyon çalışması yapılmalıdır.
·% 97,0 kriteri isteğe bağlıdır ve verilen bir Biyolojik İndikatör lotu için gözlemlenen büyüme sürelerinin dağılımını ve protokol tarafından belirlenen test içinde kullanılan sterilizasyon şartlarını dikkate almamaktadır.
Şekil 2: Test edilen biyolojik indikatörlerin inkübasyon zamanının dikey dağılım çizelgesi
·Biyolojik İndikatörlerin sanayi kullanıcıları uzatmalı inkübasyon süreleri için gerekliliği devamlı olarak zorlamışlardır. Biyolojik İndikatörler için daha uzun inkübasyon süreleri, gerçekte, tıbbi ürünleri daha güvenli yapmamakta ve açık bir şekilde Biyolojik İndikatörlerin kullanıcıları için daha yüksek maliyetle sonuçlanmaktadır.
Bu RIT protokol Birleşik Devletler dışında yaygın olarak kabul görmemiştir. Uluslar arası Standartlar Organizasyonu (ISO) TC198 (WG04) Biyolojik İndikatör çalışma grubuna dünya genelinde kabul edilecek yeni bir RIT protokolü geliştirmesi için direktif verilmiştir.
Bu çalışmada sunulan veriler fraksiyonel nem ısı sterilizasyon işlemine maruz bırakılmış olan Geobacillus stearothermophilus kendi kendine yeterli Biyolojik İndikatörleri esas almaktadır. Bu verileri, fraksiyonel nem ısı sterilizasyon işlemlerine maruz bırakılan birkaç adette Biyolojik İndikatör lotu için detaylı büyüme süresi analizlerini esas alan azaltılmış bir inkübasyon süresini niteleme için yeni bir yaklaşım geliştirilmesi için sunuyoruz.
Mevcut RIT protokolünün anlatım biçimi, kullanıcıların imalatçı tarafından açıklanandan başka bir şekilde ürünü uygulamayı arzu etmedikçe, protokolün sadece Biyolojik İndikatör imalatçılarıyla ilgili olduğu fikrini vermektedir. Bu protokol bazı düzenleyici denetçiler ve onaylı kuruluşlar tarafından kullanıcılara uygulanmıştır.
Bu gibi durumlarda, kullanıcıların Biyolojik İndikatörleri belli ürün yüklerinde üretim ölçekli sterilizasyon cihazları içinde ekspoze etmeleri gerekmektedir. RIT protokolünün bir üretim sterilizasyon cihazı içinde başarıyla uygulanması son derece güçtür, zira sterilizasyon ekspozür en az 30 Biyolojik İndikatör içinde sonuçlanmalı ve 80'den fazla Biyolojik İndikatör içinde canlı spor olmamalıdır; yani steril olmayan. Biyolojik İndikatörlerin bir RIT çalışması için maruz bırakılması [expozürü], bunların istatistiki eşlemeler [tekrarlamalar] olduğunu sağlayan bir tarzda yapılmaları önemlidir.Küçük bir araştırma kabı içinde, 100 Biyolojik İndikatörün her biri yaklaşık eş sterilizasyon şartlarına maruz bırakılır; üretim ölçekli bir sterilizasyon cihazı içinde, ekpozür şartları içinde önemli değişkenlik olabilir. Üretim ölçekli sterilizasyon cihazı içinde daha az tekdüze şartlar, özellikle azaltılmış bir letalite ekspozür yapıldığı zaman, steril olmayan Biyolojik İndikatörler arasındaki canlı kalan koloni-şekillendiren ünitelerin (CFU) adedinde daha büyük değişkenlikle sonuçlar meydana getirebilir.
RIT protokolünün bu tarzda uygulanması, sterilizasyon cihazının ve ilgili ürün yükünün fraksiyonel sterilizasyon işlemine maruz bırakılan sporların büyüme süresini aynı şekilde etkilediği fikrini vermektedir. Spor üzerindeki sterilizasyon maddesinin moleküler-seviye faaliyetinin, sterilizasyon cihazının boyutu, ürünün mevcudiyeti, veya spor inaktivasyonunun oranını etkileyen işlem değişkenlikleri ile etkilendiği nosyonunu desteklemek için yayımlanmış olan hiçbir veri yoktur.
Sterilizasyon maddeleri ile mikroorganizmaların inaktivasyonunun genellikle birinci-dereceden kinetikleri takip ettiğini vurgulamalıyız. Biyolojik İndikatörler durumuna, spor ölümü kritik bir molekülün veya sporun tekrarlanan bir vejetatif form içine gelişememesi gibi kimyasal reaksiyon sonucudur. Spor letal bir olay olmaksızın bir sterilizasyon işlemine ne kadar uzun maruz kalırsa, o kadar fazla kolateral (letal olmayan) hasar meydana gelebilir. Kollateral hasar jerminasyonun tamamlanması için gereken süreyi ve/veya bölünmek için vejetatif hücreler için gerekli süreyi etkileyebilir (üreme süresi). Bu gibi jerminasyon ve jerminasyon süresi efektleri, verilen bir Biyolojik İndikatörün bir sterilizasyon maddesine maruz kaldıktan sonra bir veya birden fazla canlı kalan sporu olduğu konusunda görsel/kimyasal bir göstergeye sahip olunması için gereken süreyi etkileyebilir.
Tanımlamalar
D-değeri. Açıklanan doz şartları altında test mikroorganizmasının popülasyonunun % 90'ının inaktivasyonunu elde etmek için gereken süre veya doz.
Biyolojik İndikatör (BI). Belirlenen bir sterilizasyon işlemine tanımlanmış bir direnç sağlayan canlı [viyabl] mikroorganizmalar içeren bir test sistemi.
En yüksek olasılıklı sayı (MPN). Pozitif ve negatif sonuçların gözlemlenen kombinasyonu üretmekten sorumlu maksimum olasılıktaki tahmin edilen popülasyon.
Sterilite teminat [güvence] seviyesi (SAL). Sterilizasyon sonrası bir madde üzerinde meydana gelen tek bir canlı mikroorganizma olasılığı. SAL teriminin genellikle 10-6 veya 10-3 olan bir sayısal değeri aldığını belirtmek isteriz. Bu sayısal [kantitatif] değer sterilite güvencesi için uygulandığı zaman, 10-6 lık bir SAL'DAN daha düşük bir değeri vardır ancak 10-3 lük bir SAL'dan daha büyük bir teminat sağlar.
Şekil 3: Canlı kalan biyolojik indikatörlerin üç alanı için inkübasyon süresinin yatay dağılım çizelgesi
MPN mülahazaları [görüşleri]
Sterilizasyon ve dezenfektasyon bilimi son 100 yıl içinde önemli derecede ilgi görmüştür. Bunun önemi, ilk önce hastalığın önlenmesi ve yayılması kavramıylailişkilendirilmiştir. Daha sonra, şarap, süt ve süt ürünleri gibi kaliteli ürünlerin yoğun üretimi önemli olmuştur. Son yüzyıl içinde ondalık sayı indirgeme değerleri veya D-değerleri kullanmak suretiyle mikrobiyal inaktivasyon oranlarını tanımlamada ve önceden bildirmede önemli adımlar atılmıştır.
Sterilizasyon bilimi rafine edildikçe, popülasyonları sıfıra yaklaştığı için canlı kalan mikrop adedini önceden bildirebilmek gerekli hale gelmiştir. Böylece, mikrobiyal letalitenin ve birinci dereceden kinetiklerin olasılığa dayanan doğası iyi organize edilmiş uygulamalı bilim haline gelmiştir. Düşük sayıda canlı kalan mikropları önceden bildirmenin bir metodu Halvarson ve Ziegler'in MPN yaklaşımıdır. MPN her Biyolojik İndikatör için canlı kalan sporların ortalama sayısının bir tahminini vermektedir.
MPN aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:
MPN= In (n ÷ r)
Burada n test edilen ünitelerin toplam adedi, ve r steril ünitelerin adedidir.
MPN yaklaşımı, eşleme [tekrarlama] Biyolojik İndikatörlerden en az birisi steril olmayan oldukça, tüm fraksiyonel negatif-tip verilere uygulanabilir (test edilen adet/steril olmayan adet). MPN yaklaşımı genel olarak % 1 ila % 99 steril Biyolojik İndikatörler aralığı içinde uygulanır. Deneysel tasarım tüm bu Biyolojik İndikatörlerin istatistiki eşlemeler olduğunu temin-garanti etmelidir.
İnaktivasyon oranlarının ve D-değerlerinin belirlenmesi için MPN yaklaşımının geçerliliği, canlı kalan eğrisi metodu ile elde edilen sonuçların karşılaştırılmasıyla teyit edilmiştir. İkinci olarak belirtilen metotla belirlenen D-değerleri genellikle MPN yaklaşımı ile tespit edilenlerle iyi uyuşmaktadır.
MPN yaklaşımı değerlidir zira yaklaşım canlı kalan sporların geniş bir fraksiyon negatif-tip veriler üzerinde önceden haber verilmesine imkan verir. Çizelge III MPN yaklaşımıyla belirlenen % 99 ila % 1'lik bir alanda canlı kalan sporların ortalama adedini listeler.
Şekil 5: 30-80 pozitif sonuç veren tüm biyolojik indikatör inkübasyon
süreleri özeti/test edilen 100 ünite
Şekil 6: Biyolojik İndikatör başına yaklaşık 1, 2, 3, 4, ve 5 sporlu
biyolojik indikatör inkübasyon süreleri.
Ayrıca listelenen, her ortalama canlı kalan spor sayısı için, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, veya 10 ile steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin adedidir, bir Poisson dağıtım hesabıyla belirlenen canlı kalan sporlar verilen ortalama adet esas alarak belirlenmiştir.
Sadece bir Biyolojik İndikatörün steril bulunduğu sterilizasyon işlemine maruz bırakılan 100 adetlik bir Biyolojik İndikatör setinde ortalama canlı kalan spor sayısı, MPN hesaplamasıyla belirlendiği kadarıyla 4.605'tir. Test edilen 100 adet Biyolojik İndikatörden 80 ve 30 steril olmayan Biyolojik İndikatör çıkması durumunda, ortama canlı kalan sayısı, beklendiği gibi, sırasıyla 1.609'dan ve 0.357'den azdır. Her 100 adet test edilen Biyolojik İndikatörden 80 ve 30 steril olmama durumu özellikle RIT protokolünün irdelemesiyle-tartışılmasıyla ilgilidir.
Eğer 100 adetlik bir Biyolojik İndikatör seti sterilizasyon işlemine tabi tutulursa ve Biyolojik İndikatörlerin 80 adedi steril değilse, Biyolojik İndikatörlerin 20 adedinin "0" canlı kalma spora sahip olduğu açıktır. MPN hesaplaması 80 steril olmayan Biyolojik İndikatör boyunca dağıtılan ortalama 1.609 adet canlı kalan spor veya toplam ~ 161 spor vermektedir. Poisson dağılım analizi Biyolojik İndikatörlerden yaklaşık 32'sinin yalnız bir canlı kalan sporu olabileceğini ve yaklaşık 2 Biyolojik İndikatörün beş canlı kalan spora sahip olacağını göstermektedir. Bir sterilizasyon işlemine tabi maruz bırakıldıktan sonra sadece 30 steril olmayan Biyolojik İndikatörün olduğu durumda, 70 adedin 0 sporu olabilir ve ~ 25 adedinin bir canlı kalan sporu olabileceği beklenebilir. Bu durumda, beş canlı kalan sporlu bir Biyolojik İndikatör çok az olasılıklıdır.
Filizlenme ve büyüme ile ilgili görüşler
Steril olmayan bir Biyolojik İndikatörün aşırı büyümesi aşağıdakilerin bir fonksiyonudur:
·Spor filizlenmesinin başlaması
·Hücre formuna dönüşüm
·Hücresel metabolizma
·Hücre bölünmesi ve çoğalması
Steril olmayan bir Biyolojik İndikatörün, steril olmama hususunun tanımlanması [idantifikasyonu] için steril olmamanın türbiditenin ve/veya örneğin pH içindeki bir değişiklikle sonuçlanan metabolik bir reaksiyonun gözle belirlenmesi esasına göre yapılıp yapılmadığının tespiti [determinasyonu] için hücre bölünmesi ve çoğalması gereklidir. Türbiditenin gözle tespiti hücresel metabolizma ve ortam içindeki mikroorganizmaların bolca büyümesini gerektirir. Bu büyümenin meydana gelmesi için, filizlenmenin başlaması, hücre formuna dönüşme, hücresel metabolizma, ve hücre bölünmesi önce oluşmalıdır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir Biyolojik İndikatörün türbidite veya pH değişimi ile steril olmadığının ilk fark edilmesi için gerekli süre, hem bir sporun filizlenmesi ve bir hücre formuna gelmesi ve geçen zamanın ve hem de hücre bölünmesi ve üreme süresi zamanının bir fonksiyonudur. Görülebileceği üzere (sol panel), eğer bir sporun filizlenmesi ve bir hücre formuna dönüşmesi için zaman 1 saat gecikirse, ancak üreme zamanı etkilenmezse, steril olmamayı tespit etmek için zaman gecikmesi de 1 saat geciktirilebilir. Hücre formunun üretilme süresi etkilenirse (sağ panel) steril olmamayı tespit etmek için süredeki gecikme üretim süresindeki artışın büyüklüğü ile ilgilidir.
Mikrobiyal büyümeden dolayı türbiditenin gözle tespiti ortalama olarak 106 hücre/mL'den daha büyük bir hücre yoğunluğu gerektirir, daha küçük hücreler ile daha büyük bir sayı gerekir. Çizelge III, 1 ila 105 arasında değişen hücre başlangıç sayıları için 106 hücre/mL'den daha büyüğünün elde edilmesi için gerekli üreme sayısını vermektedir; bakteriyal büyüme binarly fizyondur [ikiye bölünmedir], dolayısıyla, her üreme popülasyonunun ikiye katlanmasıdır. Tespit edilebilir türbidite sağlamada bir hücre için yaklaşık 20 jenerasyon (ikiye katlama) gereklidir; yani 106 hücre/mL'den daha büyük. Dolayısıyla, bir hücrenin tespit edilebilir türbidite üretmesi için süre jenerasyon süresinden 20 misli fazladır. Etkili olmayan bir sterilizasyon işlemine maruz bırakılan, çoğunun veya hepsinin büyük sayıda canlı kalan sporu olan Biyolojik İndikatörler, bir sterilite testinde, birçoğu 0 veya bir canlı kalan sporu olan düşük yüzdeli bir steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin bir işleme maruz bırakılmasından daha erken gözle görülebilir türbidite meydana getirecektir.
Önemli sayıdaki araştırma, işlemlerin spor filizlenmesini olumsuz olarak etkileyebileceğini ispat eden farklı sterilizasyon metotları ile yürütülmüştür. Sporların gerilim altındaki popülasyonları için geciktirilmiş büyümenin genellikle daha uzun üreme sürelerinden ziyade, daha uzun filizlenme süreleri sonucu olduğunu öngörülebilir. İkinci olarak belirtilen içinde sonuç almak için, bir işlem bu letal mutasyon olmaksızın üreme üzerinde bir hız-sınırlayıcı etki meydana getiren kalıtsal bir mutasyona neden olmalıdır. Bununla birlikte, örneğin spor katı, spor korteksi, veya iyonik konstitüsyon üzerindeki birçok olumsuz etkilerin, zürriyet daha uzun üreme süresiyle sonuçlanmadan filizlenmeyi geciktirdiği gösterilmiştir. Dolayısıyla, sadece olasılık esasına göre, aşırı büyüme gecikmelerinin gecikmiş filizlenme süresinden kaynaklandığı sonucuna varılabilir.
Her Biyolojik İndikatör için ortalama bir adet canlı kalan spor hedefleme RIT protokolünün en can alıcı yönü olarak görünmektedir; 30 ila 80 steril olmayan Biyolojik İndikatör "penceresi" her Biyolojik İndikatör için 0,357 ila 1,609'lık bir MPN ortalaması sağlamaktadır. Dolayısıyla protokol kendi amaçlanan maksadını yerine getirmek için uygundur. Bir sterilizasyon işlemine tabi tutma tek viyabl ancak olası olarak hasarlı sporlu bir Biyolojik İndikatör ortaya çıkardığı zaman, büyüme zamanındaki değişiklikler bu sporun metabolik/genetik konstitüsyonuna atfedilebilir. Bununla birlikte, expozür edilen bir Biyolojik İndikatör üzerinde çoklu sporlar mevcutsa, meydana gelen steril olmayan sonuç grup içindeki en çok aşırı büyümenin sonucu olacaktır. Bu husus steril olmayan sonuç meydana getiren bunu hızlı filizlenme ve bir hücre formuna
dönüşme, daha kısa üreme süresi veya bunların bir kombinasyonu ile yapsın veya yapmasın doğrudur. Bireysel sporun büyüme özellikleri verilen bir Biyolojik İndikatör üzerinde çoklu sporlar canlı kaldığı zaman maskelenebilmesi gerçeği, bu belgede ileride yapılan irdelemeler için önemlidir; uzayan büyüme süreleri gösteren Biyolojik İndikatörlerin olası olarak bir canlı kalan ancak hasarlı sporu vardır.
Aşağıdaki veriler nemli ısı sterilizasyon işlemine maruz kaldıktan sonra Biyolojik İndikatör büyüme süresinin analizi için bir temel oluşturmaktadır; burada sunulan analiz yaklaşık 4,000 Biyolojik İndikatör testinden elde edilen sonuçları esas almaktadır. Kendi kendine yeterli Biyolojik İndikatörler (EZTest, SGM Biotech) yaklaşık 105Geobacillus stearothermophilus sporları kullanılarak aşılanmıştır.
100 adet eşleme [tekrarlama] Biyolojik İndikatör grubu, steril edilmeyecek her grup için 30 ila 80'lik bir Biyolojik İndikatör hedefi ile sadece bir Biyolojik İndikatör fraksiyonunun sterilizasyonuyla sonuçlanmak için tasarlanmış bir nemli ısı sterilizasyon işlemine maruz bırakılmıştır. Her 100 Biyolojik İndikatörlü grup için, ortalama canlı kalan spor sayısı MPN yaklaşımı ile hesaplanmıştır, ve 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ve 10'lu Biyolojik İndikatör adedi bir Poisson dağılım analizi ile tahmin edilmiştir.
Çizelge II, 1 ila 99 steril olmayan Biyolojik İndikatörlerden tüm olası deneysel sonuçlar için Biyolojik İndikatör başına canlı kalan ortalama spor adedini vermektedir.
Materyaller ve metotlar
Bir seri deney ISO 18472 uyumlu direnç ölçer kullanmak suretiyle yapılmıştır. Dört ayrı Geobacillus stearothermophilus spor ürünlerinden üretilen kendi kendine yeten Biyolojik İndikatörler test edilmiştir. Dört spor ürünü, ATCC No. 7953, yedi yıllık bir zaman aralığı içinde üretilmiştir. Biyolojik İndikatörlerin on dört belirgin imalat lotu bu spor ürünlerinden üretilmiştir; bu lotlar yaklaşık 18 aylık bir zaman aralığı içinde üretilmiştir. Tüm Biyolojik İndikatör lotları ve direnç test sonuçları ISO 11138-1:2006, 11138-3:2006 ve ANSI/AAMI ST79:2006 gerekliliklerini karşılamıştır. Sterilizasyon ekspozürleri için, Biyolojik İndikatörler 14 üretim lotundan gelişigüzel seçilmiştir.
Biyolojik İndikatör grupları aşağıdaki usulde test edilmişlerdir:
1.100'lük dokuz grup ve 50'lik iki grup Biyolojik İndikatör nemli ısı sterilizasyon işlemine maruz bırakılmadan sterilite için test edilmiştir.
2.100'lük on grup Biyolojik İndikatör, her Biyolojik İndikatör için yaklaşık 300 canlı kalan sporla sonuçlanmayı hedefleyen nemli ısı sterilizasyon işlemine maruz bırakılmıştır. Bu canlı kalan spor adedi seçilmiştir, zira bu USP 32 içinde açıklandığı şekilde bir "canlı kalma süresi" ekspozürü sonucunu yakınlaştırmakta, aproksimat etmektedir.
3.100'lük Biyolojik İndikatörlerin onsekizlik grubu, her 100 adet için 30 ila 80 steril olmayan Biyolojik İndikatör sonucunu hedefleyen nemli ısı sterilizasyon işlemine, RIT protokolünde "window", maruz bırakılmıştır.
Şekil 7: 105 den 1'e kadar olan sporlu üniteler için biyolojik indikatör inkübasyon özeti
Çizelge I: 7 günden az olan azaltılmış bir inkübasyon süresini tespit etmek için FDA CDRH kriterini karşılamak için gerekli veri örneği.
Biyolojik İndikatörleri inkübe etmek ve Biyolojik İndikatör büyüme ortamındaki renk değişimi için SGM's Smart-Well sistemi (60+2°C) kullanılmıştır. Büyüme tespit edildiğinde, sistem inkübasyon zamanını saat: dakika olarak kaydetmiştir, yani 2:53. Bu deneydeki tüm Biyolojik İndikatörler toplam yedi gün için inkübe edilmiştir.
Sonuçlar
Büyüme zamanı. Şekil 2'nin sol panelinde sunulan veriler inkübasyondan önce nemli ısı sterizasyonuna maruz bırakılmayan 11 set Biyolojik İndikatör için sonuçları vermektedir; bu setin inkübasyon başlangıcında yaklaşık 105 lik CFU/BI popülasyonu vardı. İlk steril olmayan Biyolojik İndikatör 2:16'da kaydedilmiştir; son steril olmayan Biyolojik İndikatör saat 4:33'te kaydedilmiştir.
Şekil 2'nin orta panelinde sunulan veriler, inkübasyon başlangıcında yaklaşık 300 canlı kalan CFU/BI ile sonuçlanan, nemli ısı sterilizasyon işlemine maruz bırakılan 10 set 100'lük Biyolojik İndikatör için sonuçları vermektedir. İlk steril olmayan Biyolojik İndikatör saat 2.53'te kaydedilmiştir; son steril olmayan BI saat 7:14'te kaydedilmiştir (Şekil 4'e bakın).
Şekil 2'nin sağ paneli içinde sunulan veriler, test edilen her 100 adet için için 30 ila 80 steril olmayan Biyolojik İndikatörün gözlemlendiği, nemli ısı sterilizasyon işlemine maruz bırakılan tüm 18 set 100'lük Biyolojik İndikatör için sonuçlar vermektedir. İnkübasyonun başlangıcında, canlı kalan CFU 0 ila ~6/BI aralığında değişmiştir. İlk steril olmayan Biyolojik İndikatör saat 3:35'te kaydedilmiştir; son steril olmayan BI saat 18:41'de kaydedilmiştir. Bu veriler her test grubu için steril olmayan Biyolojik İndikatörlerin kesin adedi ile ilgili olarak artan düzende düzenlenmektedir. Paneli içindeki en soldaki veriler 33 steril olmayan Biyolojik İndikatörü yansıtmaktadır; en sağdaki verilerin 80 steril olmayan sonucu olmuştur.
Bu üç set Biyolojik İndikatörlerin her biri için tüm büyüme sürelerinin dağılım çizelgeleri Şekil 3'de gösterilmiştir.
Tablo II: Biyolojik indikatör başına hayatta kalan kökenlerin en olası sayısı
Tablo III: 1 ila 100.000 arası hücre sayısından başlamak üzere 1 milyon hücreden daha büyük bir sayıya ulaşmak için gerekli olan üretimler(jenerasyonlar)
Şekil 2 ve 3'te görülebileceği üzere, nemli ısı sterilizasyonuna maruz bırakılmayan Biyolojik İndikatörler (Şekil 2'nin sol paneli ve Şekil 3'ün alt çizimi-krokisi) en kısa tüm büyüme sürelerini oldukça küçük intra veya inter-lot değişikliği ile göstermektedir (büyüme tespit edildiğinde süre inkübatör sistemi tarafından kaydedilmiştir).
Biyolojik İndikatörler nemli ısı sterilizasyonuna ~300 canlı kalan CFU/BI (şekil 2'nin orta paneli ve Şekil 3'ün merkez çizimi) ile sonuçlanacak bir tarzda maruz bırakıldığı zaman, tüm büyüme süreleri intra-lot değişkenliği içinde belirgin bir artış ile biraz artmıştır. Büyüme süresi içindeki artışın nedeni inkübasyonun başlangıcında düşük sayıdaki canlı kalan sporların adedi ile ilişkili gibi görünmektedir. Bu Biyolojik İndikatörler, maruz bırakılmayan Biyolojik İndikatörler için ~105 CFU'ya karşın, ~300 CFU ile başlamaktadır, yaklaşık dokuz jenerasyonluk bir fark.
30 ila 80 steril olmayan sonuçlu Biyolojik İndikatör/100 maruz bırakılan (Şekil 2'nin sağ paneli ve Şekil 3'ün üst çizelgesi) nemli ısı sterilizasyonuna maruz bırakılan Biyolojik İndikatörler inter-ve intra-düşük değişkenlik içinde büyük bir artan konkomitant ile tekrar artan büyüme süreleri göstermiştir. Yukarıdaki şekilde, tüm büyüme zamanı içindeki artış steril olmayan olarak kaydedilecek yeterli pH değişikliği meydana getirmek için gerekli büyük jenerasyon sayısından dolayıdır. Değişkenlik içindeki büyük artış açık bir şekilde, filizlenme ve/veya üreme zamanının hızı ile ilgili zayıflatılacak olan büyük bir potansiyel ile sadece bir adet canlı kalan CFU'su olması beklenebilen her test grubu içindeki büyük sayıdaki Biyolojik İndikatörlerle ilgilidir. (Şekil 5'e bakın).
MPN ve poisson dağılım analizi
Her test edilen 30 ila 80 steril olmayan Biyolojik İndikatörün gözlemlendiği nemli ısı sterilizasyonu ekspozürlerinden elde edilen sonuçlar Çizelge II içinde gösterilen canlı kalan CFU ve Poisson dağılım tahmini ortalama sayısının MPN tahminini kullanarak daha fazla analiz edilmiştir. Her sterilizasyon eksyozürünün sonucu için yukarıdaki tartışılan varsayımını kullanılarak, tahmin edilen bir canlı kalan CFU sayısı her gözlemlenen büyüme süresine tahsis edilmiştir; Poisson dağılım analizi içindeki en yüksek canlı kalan CFU sayısı en kısa gözlemlenen büyüme süresine tahsis edilmiştir. Bir sonraki en düşük canlı kalan CFU adedi tekrar en kısa kalan büyüme sürelerine tahsis edilmiştir; bu işleme tüm önceden bildirilen canlı kalan CFU > 1 değerleri tahsis edilene kadar devam edilmiştir. Kalan büyüme sürelerine bir canlı kalan CFU değeri tahsis edilir. Örneğin, ekspozürden sonra 80 steril olmayan Biyolojik İndikatörü olan Biyolojik İndikatör lotunun; beş CFU'lu iki Biyolojik İndikatör, dört CFU'lu altı Biyolojik İndikatör, üç CFU'lu 14 adet Biyolojik İndikatör, iki CFU'lu 26 Biyolojik İndikatör, sadece bir CFU'lu 32 Biyolojik İndikatör ve kalan canlısı olmayan CFU'lu yirmi Biyolojik İndikatörü olduğu önceden bildirilebilir. Şekil 6, önceden tahmin edilen beş ila bir CFU'lu ekspoze Biyolojik İndikatörler için Biyolojik İndikatör büyüme sürelerini göstermektedir. Bu verilerin bir özeti Şekil 7 ve Çizelge IV içinde verilmiştir.
Yaklaşık 105 sporluBiyolojik İndikatör başlatma inkübasyonundan ilk steril olmayan sonuç 2.16 idi. Bu ~300 sporlu Biyolojik İndikatör başlatma inkübasyon grubundan ilk steril olmayan Biyolojik İndikatör için süreden 37 dakika daha hızlıydı. Bu bir sporu olduğu önceden bildirilen Biyolojik İndikatörden üç saat ve iki dakika hızlıydı. Her grup Biyolojik İndikatör içindeki ilk pozitif ve son pozitif arasındaki süre, önceden tahmin edilen popülasyon azaldıkça artmaktadır.
İrdeleme
Önce, bir Biyolojik İndikatör üzerindeki canlı kalan CFU'nun sayısı ve tüm büyüme süresi arasındaki bir ters ilişki olduğu açıktır. Bu husus önceden tahmin edilmiştir, zira tespit edilebilir bir hücre yoğunluğu elde etmek için gerekli olan süre ve/veya komülatif metabolik faaliyet, viyabl CFU başlama seviyesi, bunun daha düşük olduğu zamandan yüksek olduğundan daha az zaman gerektirir. Bu da, 105 lik hücre/mL bir hücre yoğunluğu, 1 hücre/mL lik bir başlatma popülasyonu ile karşılaştırıldığında, 103 hücre/mL lik bir başlatma popülasyonu için olan sürenin yarısında elde edilebilir, filizlenme ve üreme süreleri eşit olmaktadır.
Tablo IV: Sayım veya Poisson dağıtım analizi esaslı Tahmin yoluyla belirlenen farklı CFU numaraları ile biyolojik indikatörler için büyüme zamanı
İkincisi, büyüme süreleri birkaç yüz canlı kalan CFU'lu Biyolojik İndikatörler için normal bir dağılım takip edecek gibi görünmektedir; birkaç canlı kalan CFU'lu Biyolojik İndikatörler steril olmayan olarak değerlendirilmeden önce, oldukça uzun süreler sergileyen ölçülebilir bir yüzde ile oldukça daha yüksek değişken büyüme sürelerine sahiptir. Ekspozürden sonra 100 adedin 30 ila 80'inin steril olmadığıbir grup içindeki yaklaşık 1000 steril olmayan Biyolojik İndikatörün, 10 Biyolojik İndikatör veya yaklaşık yüzde 1 uzatılmış bir büyüme süresi sergilemiştir.
Üçüncüsü, veriler Biyolojik İndikatörlerin geciken büyümesinin gözlemlendiği ve ekspoze olan [maruz bırakılan] Biyolojik İndikatörlerin önemli adedinin veya büyük çoğunluğunun sadece bir adet canlı CFU'su olduğu yerdeki durumlarla sınırlı olduğu hipotezini desteklemektedir.
.jpg)
